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免疫金銀染色(IGSS)操作流程

一、基本原理

    免膠體金檢測技術是用金屬離子和金屬蛋白復合物應用免疫組化原理檢測組織內抗原抗體的技術,常用膠體金(鐵、汞等)重金屬離子。由于膠體金容易制成各種大小的顆粒且有很高的電子密度及分辨率,又不影響抗體的活性,因此既可用于免疫組化又適于免疫電鏡技術。

  • 操作步驟

1、石蠟切片IGSS

  (1)切片脫蠟至水。

    (2)0.1%胰蛋白酶37℃消化20min或抗原修復20min(98℃),自然冷卻至室溫。

    (3)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min。

    (4)l%EA(卵蛋白)15min,不洗。

    (5)適當稀釋的特異抗體室溫4h或4℃孵育20h,或37℃孵育1h。

    (6)0.05m01/L(pH7.4)TBS洗3×5min。

    (7)0.02m01/L(pH7.4)TBS(內含0.1%BSA)洗10min。

    (8)1%EA 15min,不洗,1:10~1:20稀釋的PAGlonm室溫孵育1h,或37℃孵育30min。

    (9)0.05mol/L(pH7.4)TBS洗10min。

    (10)1%戊二醛洗10min。

    (11)雙蒸水洗5min。

    (12)1%明膠洗5min。

    (13)銀避光顯影8~15min。

    (14)雙蒸水洗15min。

    (15)固定:用顯影定影液(1:4或1:10)固定5min,也可以用15%硫酸鈉-20%硫代硫酸鈉混合液固定1~3min,或用1%戊二醛固定5min,50℃溫水洗3~6min。

    (16)襯染,核固紅襯染3min或甲基綠襯染3min。

    (17)常規脫水,二甲苯透明,常規樹膠封片。

    (18)鏡檢:陽性物質呈黑色或黑褐色,顆粒分布于抗原—抗體反應部位;背景較干凈,呈紅色。

2、冰凍切片IGSS

     做冰凍切片的組織可先經過固定再作切片,也可先制作冰凍切片,然后再固定。這要根據保存抗原的需要而定,固定過的組織可用含20%蔗糖的PBS(0.1mol/L,pH7.4)浸泡過夜,使切片減少冰結晶,保持組織細胞良好的形態結構。切片人0.05mol/L(pH7.4)TBS洗3×3min,染色步驟同石蠟切片。

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